ایمونوسیتوشیمی (Immunocytochemistry (ICC 

آنالیزها و تجهیزاتزیست فناوری

نوشته شده توسط:

ایمونوسیتوشیمی (ICC) روشی برای تشخیص و شناسایی پروتئین‌ها و پپتیدها در سلول‌ها است که با استفاده از بیومولکولها یا آنتی‌بادی‌های خاص انجام می‌شود. پروتئین ها در زیر میکروسکوپ با اتصال یک آنتی‌بادی ثانویه دارای رنگ فلوروفور یا آنزیم به آنتی‌بادی اولیه قابل  مشاهده هستند. این تکنیک در حال حاضر یکی از روش‌های مهم در پاتولوژی پزشکی است.

تکنیک ایمونوسیتوشیمی چیست؟

تشخیص پروتئین‌ها با کمک آنتی بادی های نشان‌دار روی سلول ها و با کمک میکروسکوپ، توسط تکنیک ایمونوسیتوشیمی انجام می‌گیرد. برای درک بهتر این روش باید ریشه این کلمه را مورد بررسی قرار دهیم. ایمونو به کاربرد مولکول‌های آنتی ژن و آنتی‌بادی موجود در این تکنیک اشاره دارد، سیتو به معنی است که این مطالعه پروتئین در سلول صورت می گیرد و شیمی که نشان از واکنش شیمیایی در این تکنیک است.

مراحل انجام ایمونوسیتوشیمی

نحوه انجام کار ICC

ایمونوسیتوشیمی معمولاً در چهار مرحله متوالی انجام می‌شود.

  • ابتدا سلول‌ها بر روی یک پایه جامد قرار می‌گیرند ، به عنوان مثال داخل یک پلیت ۹۶چاهکی با کف شیشه‌ای. بسته به نوع سلول و تکنیکی برای قرارگیری سلول‌ها روی پلیت انجام می‌شود، زمان انکوباسیون ممکن است قبل از اقدام به رنگ آمیزی ایمونوهیستوشیمی لازم باشد. زمان انکوباسیون  از نیم ساعت تا ۲۴ ساعت متغییر است.
  • در مرحله دوم ، رنگ آمیزی سلول‌ها با روش ایمونو: سلول‌ها ثابت و نفوذپذیر شده و با آنتی‌بادی‌ها رنگ آمیزی می‌شوند. در مرحله تثبیت، پروتئین‌ها را در محل خود در سلول حفظ کرده و  وضعیت شیمیایی و ساختاری آنها را حفظ می‌شود. این کار را می‌توان با اتصالات متقابل یا رسوب دادن پروتئین‌ها با استفاده از حلال‌های آلی انجام داد. در طی نفوذپذیری، غشاها با استفاده از حلال‌ها یا دترجنت‌ها سوراخ می‌شوند و به آنتی‌بادی‌ها اجازه می‌دهند تا از غشاها عبور کنند. بدون این مرحله آنتی‌بادی‌ها به دلیل اندازه آنها نمی‌توانند وارد سلول شوند.

((برای افزایش نفوذ پذیری سلول‌ها نیاز به تثبیت دارند و از این رو تکنیک ایمونوسیتوشیمی تنها به مطالعه بر روی سلول‌های مرده محدود می‌شود.))

  • در مرحله سوم، سلول‌ها با استفاده از میکروسکوپ قابل مشاهده هستند و تصاویر با استفاده از یک دوربین ثبت می‌شود.
  • در مرحله آخر، تصاویر مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفته و ساختارهای سلولی بررسی می‌شوند.

 

مکانیسم‌های رنگ‌آمیزی

برای رنگ‌آمیزی ICC سیستم‌های مختلفی وجود داردکه در هریک ا آن ها از مولکول‌های خاصی به عنوان گزارشگر استفاده می‌شود. یکی از آن‌ها استفاده از آنتی‌بادی‌های همراه آنزیم است: پس از افزودن سوسبسترا به محیط، آنزیم‌ها در محل اتصال آنتی‌بادی در نمونه، واکنش رنگی قابل مشاهده را کاتالیز می‌کنند. به عنوان مثال  آنزیم متداول پراکسیداز ترب کوهی (HRP) می‌تواند  (diaminobenzidine (DAB  را به یک رسوب قهوه‌ای رنگ تبدیل کند که در محل واکنش قرار می‌گیرد. لکه قهوه‌ای رنگ ممکن است با استفاده از میکروسکوپ نوری دیده شود.

نوع دیگراز مولکول‌های گزارشگر، فلورسانس است که به خصوصیات فیزیکی یک مولکول متکی است تا با جذب نور در یک طول موج با انرژی بالاتر برانگیخته شود. پس از آن مولکول به حالت پایه برمی‌گردد، در حالی که تابش نور با طول موج بلندتر دارد. به این مولکول‌ها فلوروفور گفته می‌شود و ممکن است با استفاده از میکروسکوپ فلورسانس مشاهده شوند. این نوع میکروسکوپ قادر به تحریک فلوروفورها است و در عین حال میزان تابش آنها را نیز تشخیص می دهد. از آنجا که فلوئوروفورهای مختلف با طول موج‌های مختلف از نور برانگیخته می‌شوند و همچنین در طول موج‌های مختلف  نور را ساطع می‌کنند، ممکن است چندین فلوروفور با رنگ‌های مختلف در یک نمونه با هم مورد استفاده قرار بگیرند. این امکان دستیابی به تصاویر چند رنگی را فراهم می‌کند، جایی که هر رنگ یک هدف خاص آنتی ژن را نشان می‌دهد. همپوشانی طیفی از پروفایل‌های برانگیختگی و انتشار فلوروفورها یک عامل محدود کننده در هنگام افزودن انواع مختلف فلوروفورها به یک نمونه است. فلوئوروفورها با خصوصیات طیفی مشابه به راحتی قابل تفکیک نیستند و تصویر بدست آمده ترکیبی غیرقابل تشخیص از سیگنال های مختلف را نشان می‌دهد، که باعث اختلال در تطبیق پذیری تجزیه و تحلیل ایمونوفلورسانس می‌شود.

علاوه بر آنتی‌بادی‌های دارای فلوروفور، مولکول‌هایی وجود دارند که به خودی خود فلورسانس هستند و توانایی ذاتی برای اتصال ویژه با سایر مولکول‌ها را دارند. این مولکول‌ها ممکن است همراه با آنتی‌بادی‌های دارای فلوروفور استفاده شوند. یک مثال (diamidino-2-phenylindole (DAPI است که به مولکول DNA متصل می شود. این مولکول گزارشگر توسط نور ماوراء بنفش برانگیخته می شود و سپس نور آبی را ساطع می کند.

 

مثال هایی از انواع مولکول‌های گزارشگر

 

تشخیص مستقیم و غیرمستقیم

تشخیص پروتئین‌ها به روش ایمونوسیتوشیمی می‌تواند مستقیم یا غیرمستقیم باشد. در روش مستقیم، از یک آنتی‌بادی به عنوان مولکول گزارشگر استفاده می‌شود. این روش سریع و اختصاصی است. با این حال، معمولاً به اندازه کافی برای اکثر پروتئین‌ها حساس نیست زیرا تعداد نسخه‌های موجود پروتئین، برای ارائه سیگنال قابل مشاهده بسیار کم است. هدف قرار دادن یک پروتئین خاص در یک سلول با یک آنتی‌بادی اولیه و یک آنتی‌بادی ثانویه همراه با گزارشگر که به آنتی بادی اولیه هدایت می‌شود یک روش بسیار دقیقتر است . افزایش حساسیت و اختصاصیت روش غیرمستقیم ناشی از اتصال متعدد آنتی‌بادی‌های ثانویه به آنتی‌بادی اولیه است که باعث تقویت سیگنال می‌شود. مزیت دیگر روش عیرمستقیم افزایش انعطاف‌پذیری به دلیل امکان تغییر ترکیب آنتی‌بادی اولیه و ثانویه است. از معایب روش غیرمستقیم نیز می‌توان به پروتکل پر زحمت‌تر و وقت‌گیر آن و احتمال اتصال غیراختصاصی آنتی‌بادی ثانویه اشاره کرد .

مقایسه روش مستقیم و غیرمستقیم

کاربردهای شاخص ایمونوسیتوشیمی

  • در تهیه اطلس پروتئین انسانی، از ICC با فلورسانس به عنوان مولکول گزارشگر برای تجزیه و تحلیل توزیع درون سلولی پروتئین‌ها (کل پروتئوم انسانی) برای ساختن یک اطلس سلولی با وضوح درون سلولی استفادهشد (باربه و همکاران ، ۲۰۰۸).
  • در سال ۲۰۱۰ stadler  و همکارانش جایگاه هر پروتئین درون سلولی را  در سه رده سلولی مختلف انسانی با استفاده از آنتی بادی های تولید شده در پروژه اطلس پروتئین انسانی مورد مطالعه قرار دادند . در این پروژه سلول‌ها در شرایط آزمایشگاهی کشت داده شدند و با استفاده از فرمالدئید و تریتون X-100  تثبیت و نفوذپذیر شدند و سپس با رنگ آمیزی ایمونوفلورسانس رنگ آمیزی شدند. علاوه بر آنتی‌بادی‌های پروژه اطلس پروتئین انسانی، از دو آنتی‌بادی مرجع برای رنگ‌آمیزی شبکه آندوپلاسمی و میکروتوبول‌ها به ترتیب استفاده شد. سلول‌ها با پروب‌های هسته ای DAPI نیز مورد بررسی قرار گرفتند. میکروسکوپ روبشی لیزری کانفوکال مجهز به بزرگنمایی ۶۳ برابر ، برای به دست آوردن تصاویری با وضوح بالا در این مطالعات  مورد استفاده قرار گرفت.
  • علاوه بر مطالعات جایگاه‌های پروتئین‌های درون سلولی از ICC برای تهیه پنل‌های رده های سلولی و الگوی بیان پروتئین‌های آن‌ها می‌توان استفاده کرد(Andersson و همکارانش ۲۰۰۶).

تصویر سلول های HeLa با آنتی بادی Anti-EMD، شبکه اندوپلاسمی به رنگ سبز،میکروتوبولهای هسته قرمز و پروب های هسته‌ای به رنگ آبی دیده می‌شوند.

تصویری از سلول های رده HeLa با آنتی بادی anti-TUFM،قسمت‌های سبز پروتئین‌های میتوکندریایی را نشان می‌دهد و میکروتوبول‌های هسته قرمز و پروب‌های هسته‌ای به رنگ آبی دیده می‌شوند.

 

پیدا کردن پروتئین‌ها در سلول‌های مختلف را به آنابیز بسپارید

آنابیز با همکاری آزمایشگاه های تخصصی پروتئین کشور قادر است پژوهشگران و دانشجویان فعال در زمینه تحقیقات بر روی پروتئین‌های سلولی را یاری کند تا تشخیص و تصویربرداری از پروتئین‌های مورد مطالعه خود را با اطمینان خاطر به ما بسپارند.

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *