تکنیک SDS_PAGE

دسته‌بندی نشده

نوشته شده توسط:

تکنیک SDS_PAGE یک روش کم هزینه، سریع و تکرار پذیر جهت مطالعه پروتئین ها می باشد. SDS_PAGE به طور معمول برای بررسی مراحل خالص سازی، محاسبه مقدار نسبی و تعیین وزن مولکولی پروتئین ها به کار می رود. در تکنیک SDS_PAGE به دلیل استفاده از ماده سدیم دودسیل سولفات (SDS) و همچنین ویژگی های عالی ژل پلی اکریل آمید قدرت تفکیک پروتئین ها بسیار خوب می باشد. SDS   یک دترجنت آنیونی می باشد که با اتصال به نواحی هیدروفوب پروتئین ها آن­ها را دناتوره می کند. در واقع مولکول SDS با اتصال به پروتئین ها بار طبیعی آن­ها را می پوشاند و توزیع یکنواختی از بارهای منفی بر روی آن ایجاد می نماید. در نتیجه این اتفاق، جداسازی پروتئین ها تنها بر اساس وزن مولکولی­شان صورت می گیرد. جهت خطی نمودن مولکول های پروتئینی، آن­ها را در مقدار کافی SDS  و ماده احیا کننده مرکاپتواتانول جهت از بین بردن باندهای دی سولفیدی و نیز دقایقی حرارت قرار می دهند. مقدار SDS لازم جهت اتصال به پروتئین ها، ۱٫۴ گرم SDS به ازای هر گرم پروتئین می باشد. حالا در هنگام Run نمودن الکتروفورز، جداسازی پروتئین ها تنها بر اساس وزن مولکولی ­شان خواهد بود. بدین معنا که هرچه اندازه مولکول بزرگ­تر باشد، حرکت آن به دلیل اصطکاک با محیط اطراف کمتر خواهد بود.

معمولا مولکول SDS به قندها متصل نمی گردد، از این رو پروتئین هایی که بخش قندی آنها بزرگ است، نسبت به وزن مولکولی خود SDS کمتری می گیرند. با کاهش اتصال مولکول های SDS در آن­ها، حرکت کندتری بر روی ژل خواهند داشت. این امر موجب تخمین وزن آن­ها بیش از وزن طبیعی­شان می­شود. جهت حل این مشکل، می­توان SDS_PAGE را در ژل های دارای شیب غلظتی یا در سیستم های بافری تریس – بورات SDTA به جای بافر معمول تریس – گلیسین قرار داد. بورات با اتصال به قندها، موجب افزایش میزان بار منفی گلیکوپروتئین خواهد شد و تا حدود زیادی کاهش اتصال به SDS جبران خواهد شد.

اثر ژل پلی اکریل آمید

ژل پلی اکریل آمید نقش بسیار موثری در تفکیک پروتئین ها در SDS_PAGE دارا می باشد. قطر منافذ موجود در ژل پلی اکریل آمید که متاثر از غلظت دو جزء سازنده آن می باشد (C % , T %) دامنه وزنی قابل تفکیک در SDS_PAGE را مشخص می کند. به عنوان مثال در ژل با غلظت ۵، ۱۰ و یا ۱۵ ٪ با فرض C معادل ۲٫۶ درصد) به ترتیب می توان پروتئین های در محدوده ۲۰-۳۰۰ ، ۱۵-۲۰۰ و ۱۲-۱۰۰ کیلو دالتون) را جدا نمود. باید در نظر گرفت که رابطه مسافت طی شده و لگاریتم وزن مولکولی در محدوده کمی به صورت خطی می باشد. به منظور افزایش میزان این رابطه خطی، باید الکتروفورز را در شیبی از غلظت ژل پلی اکریل آمید انجام داد.

تکنیک SDS-PAGE در شرایط احیایی و غیراحیایی

پیوندهای دی سولفیدی درون رنجیره ای یا بین زنجیره ای نقش عمده ای در شکل گیری ساختمان سوم و چهارم پروتئین ها دارند. احیای این پیوندها با استفاده از مواد تیول دار (مانند ۲- مرکاپتو اتانول) منجر به از بین رفتن ساختمان های سوم و چهارم پروتئین ها خواهد شد. پروتئین های دارای پیوند دی سولفیدی، دارای حرکت متفاوتی در شرایط احیایی و غیر احیایی الکتروفورز می باشند. احیا شدن این پیوندهای دی سولفیدی موجب جدا شدن زیرواحدهای پروتئینی در پروتئین­های چند زیر واحدی و همچنین خطی شدن کلیه پروتئین­ها می شود که این امر موجب اتصال یکنواخت SDS به پروتئین خواهد شد. بنا براین می­تواند با مقایسه الگوی الکتروفورز احیایی و غیر احیایی یک پروتئین اطلاعات زیادی راجع به ساختار سوم آن بدست آورد. DTT و ۲- مرکاپتواتانول رایج ترین احیا کننده های پیوند دی سولفیدی می­باشند.

سیستم بافری

ژل پلی اکریل آمید از دو قسمت ژل متراکم کننده (Stacking gel) و ژل جداکننده (resolving gel)  تشکیل شده است. ژل متراکم کننده در بالا قرار گرفته است و مواد تشکیل دهنده آن با ژل جدا کننده متفاوت می باشد. در ژل متراکم کننده به دلیل تراکم یکسان بار الکتریکی کلیه پروتئین­ها حرکت آن­ها با سرعت یکسانی می باشد و به صورت یک لایه نازک در می آیند. اما با رسیدن مجموعه پروتئینی به ابتدای ژل جدا کننده ، جداسازی آن­ها بر اساس وزن مولکولی شروع می شود. بار خالص پروتئین – SDS در دامنه pH بین ۷-۱۰ تغییر چندانی نمی­کند و حرکت پروتئین ها در این دامنه نیز تفاوت محسوسی ندارد.

بافر تریس – گلیسین پر استفاده ترین سیستم بافری ناپیوسته در SDS_PAGE می­باشد. در سیستم بافری ناپیوسته ترکیب یونی ، pH بافر در نمونه، ژل و مخازن با یک­ دیگر متفاوت می­باشد. درسیستم بافری ناپیوسته حتی ژل نیز غالبا شامل دو قسمت (ژل بالا و ژل پایین) می باشد. در سیستم بافری ناپیوسته کارایی الکتروفورز خیلی وابسته به حجم نمونه نمی باشد.

در سیستم بافری پیوسته غلظت و ترکیب یون ها و pH در سراسر مسیر الکتروفورز یکسان می باشد.

سیستم بافری لاملی متداول­ترین سیستم بافری ناپیوسته در الکتروفورز می باشد. در این سیستم نمونه پروتئین و و ژل بالا حاوی بافر تریس – هیدروکلرید با pH=6.8 و ژل پایین حاوی بافر تریس هیدروکلرید با pH=8.8 و بافر مخازن (بافر الکترودها) شامل تریس – گلیسین با pH=8.3 می باشد.

آماده سازی نمونه

برای آماده سازی نمونه در SDS_PAGE بافر نمونه را با نسبت خاصی به نمونه می افزایند، سپس برای دقایقی در آب جوش قرار می دهند. در این شرایط پروتئین ها به واسطه اثر SDS و ماده احیا کننده (در حالت الکتروفورز احیایی) کاملا دناتوره می شوند. میزان SDS در بافر نمونه باید بارها بیشتر از میزان پروتئین باشد (میزان ۳ به ۱) تا کاملا از اشباع شدن پروتئین با SDS اطمینان حاصل شود.

وجود گلیسرول یا ساکارز در بافر نمونه باعث سنگین شدن نمونه و قرار گرفتن آن در ته چاهک می شود. این موضوع خصوصا زمانی اهمیت بالایی پیدا می کند که مدت زمان نمونه گذاری زیاد طول بکشد.

در SDS_PAGE معمولا بعد از افزودن بافر نمونه به پروتئین و قبل از نمونه گذاری، مخلوط آن­ها را دقایقی (۱۵-۲۰ دقیقه بسته به نوع پروتئین) در آب جوش قرار می­دهند. حرارت موجب جدا شدن زیرواحدهای پروتئین­های چند زیرواحدی و تسهیل اشباع شدن زنجیره­های پلی پپتیدی با استفاده از  SDS می شود. بعلاوه، این کار موجب غیر فعال شدن بسیاری از پروتئازها شده و امکان تجزیه پروتئین­ها توسط آن­ها را از بین خواهد برد. اما با این وجود بسیار از پروتئا­زها در این شرایط سالم باقی می­مانند و لازم است مهار کننده پروتئاز به نمونه ها افزوده شود.

بعضی پروتئین­ها تحت تاثیر SDS تنها، رفتاری مشابه با حالت تحت تاثیر SDS و حرارت دارند ولی بعضی پروتئین­ها در هر حالت رفتار متفاوتی از خود بروز می دهند.

مواردی که SDS_PAGE کاربرد دارد عبارت است از :

۱- تصدیق اندازه پروتئین­ها

۲- شناسایی پروتئین­ها

۳- تعیین خلوص پروتئین­ها

۴- شناسایی پیوند­های دی سولفید

۵- کمیت و مقدار پروتئین­ها

۶- آشکار کردن عیوب

انجام تکنیک SDS_PAGE در آنابیز

ما در آنابیز توانستیم با کمک آزمایشگاه های معتمد و با کیفیت بستر مناسبی را فراهم کنیم تا به شما محققان و پژوهشگران گرامی در انجام تکنیک SDS_PAGE در زمینه مولکولی خدمت رسانی نماییم.

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *