western blot (وسترن بلات)

دسته‌بندی نشده

نوشته شده توسط:

western blot (وسترن بلات) چیست؟

وسترن بلاتینگ یا ایمونوبلاتینگ یک تکنیک بسیار پرکاربرد و مرسوم در زمینه تشخیص پروتئین ها در حوزه بیولوژی مولکولی می باشد. در ابتدا مولکول های پروتئین با استفاده از تکنیک SDS-PAGE جدا می شوند و سپس جهت تشخیص نهایی و دقیق پروتئین مورد نظر از تکنیک وسترن بلات استفاده می شود.

در western blot (وسترن بلات) باندهای پروتئینی از ژل به غشایی ماننده نیتروسلولز که قابلیت اتصال و تثبیت پروتئین ها را دارد، منتقل می شوند. در عمل بلاتینگ مولکول­های پروتئین از زمینه ژل خارج می شوند و در سطح غشا در همان موقعیت قرار می گیرند. از این رو به سادگی و با مقدار کمتری از مواد می­توان به مطالعه آن ها پرداخت، یا آن ها را جدا نمود و مورد استفاده قرار داد. به منظور تشخیص پروتئین ها یا آنزیم های منتقل شده به غشا می­توان از لیگاندهای اختصاصی یا سوبستراهای مربوطه استفاده کرد. آنتی بادی ها از متداول­ترین موادی هستند که برای تشخیص اختصاصی پروتئین ها در غشا بکار می روند. از همین رو چنین روش هایی به ایمونوبلاتینگ معروفند.

روش آزمایش

  • مقداری از بافر تانک را در یک ظرف پلاستیکی یا شیشه ای تمیز بریزید. ژل را پس از بریدن بخش متراکم کننده آن حداقل ۱۰ دقیقه در بافر قرار دهید.
  • با کمک پنس و قیچی تمیز، یک ورقه از غشا به اندازه ژل ببرید. از تماس دست بدون دستکش با غشا خودداری کنید. غشا را با آب مقطر (برای غشای نیتروسلولز) یا متانول (برای غشای PVDF) خیس کنید و در ظرف حاوی بافر انتقال دهید. چندین لایه کاغذ صافی متناسب با ابعاد ژل تهیه و همراه اسفنج ها در بافر خیس کنید و در بافر خیس کنید. سپس مطابق شکل زیر اجزای گفته شده را روی هم قرار دهید. این مجموعه از پایین به بالا شامل اسفنج، چند لایه کاغذ صافی، ژل، غشا، چند لایه کاغذ صافی و لایه اسفنج می باشد. بعد از گذاشتن هر لایه، حباب های هوای احتمالی را با یک میله شیشه ای یا لوله آزمایش از حد فاصل لایه ها خارج کنید.
  •  مجموعه بلات را در قاب پلاستیکی مربوطه محکم کنید و در تانک بلات که تا ارتفاع مناسب با بافر پر شده است، قرار دهید. سپس به مدت ۱-۴ ساعت در شدت جریان ۲۰۰-۴۰۰ میلی آمپر الکتروفورز نمایید.

 

رنگ آمیزی عمومی پروتئین ها در غشا

بعد از بلاتینگ پروتئین ها برای ادامه آزمون western blot (وسترن بلات) لازم است اطلاعاتی در مورد کیفیت و کمیت باندهای انتقال یافته بدست آید، یا پروتئین خاصی به هدف مطالعات بعدی (مثلا تعیین توالی) مشخص گردد. برای این کار می توان غشای نیتروسلولز یا PVDF را با مواد مختلف رنگ امیزی نمود . رنگ آمیزی پروتئین ها بسته به هدف آزمایش ممکن است به صورت قابل برگشت و یا غیر قابل بزگشت باشد. پانسو-اس، جوهر هندی، آمیدوبلک و کوماسی آبی از مواد متداول برای رنگ آمیزی عمومی پروتئین ها در غشا هستند. رنگ آمیزی ژل نیز کامل یا ناقص بودن انتقال پروتئین ها را نشان می دهد. باندهای پروتئین در ژل و غشا دقیقا هم موقعیت نمی باشند، زیرا ژل در طی متعادل سازی در محلول انتقال به دلیل وجود متانول ، مقداری کوچک می شود.

 

ماده رنگ آمیزی حساسیت (میکروگرم در باند) نوع غشا
فاست گرین FG ‍۵/۱< نیتروسلولز، PVDF
پانسو-اس ۵/۱< نیتروسلولز، PVDF
کوماسی آبی R-250 ۵/۱ PVDF
آمیدوبلک ۱۰B ۵/۱ نیتروسلولز، PVDF
جوهر هندی ۱/۰ نیتروسلولز، PVDF
آهن کلوئیدی ۰۳/۰ نیتروسلولز، PVDF و نایلون
بیوتین و آویدین-پراکسیداز ۰۳/۰ نیتروسلولز، PVDF و نایلون
طلای کلوئیدی ۰۰۴/۰ نیتروسلولز، PVDF

 

 تشخیص با آنتی بادی

در آنالیز Western blot (وسترن بلات) پس از بلاتینگ پروتئین ها و بلوکه کردن غشا، مرحله تشخیص اختصاصی را می توان انجام داد. همان گونه که قبلا نیز گفته شد ایمونوبلاتینگ در بسیاری از موارد به هدف تشخیص طبی است. در این موارد باندهای انتقال یافته شامل همه یا بخشی از پروتئین های پیکره میکروب (باکتری، ویروس یا قارچ) است که وجود یا عدم وجود آنتی بادی ضد سرم آنها در سرم انسان یا حیوان بررسی می گردد.

ماده مسدود کننده

توضیحات

آلبومین سرم گاو در غلظت ۲-۵ درصد در بافر (معمولا PBS) برای ۱-۲ ساع بکار می رود. برای مسدود کردن نایلون غلظت ۱۰ درصد آن به مدت ۱۲-۱۶ ساعت لازم است.
شیر خشک بدون چربی در غلظت ۳ درصد بکار می رود. بسیار ارزان است. بدلیل محتوای قندی زیاد از اتصال لکتین ها یا آنتی بادی های ضد کربوهیدرات (به عنوان مولکول های نشان دار) جلوگیری می نماید
آلبومین مرغ در غلظت ۱ درصد بکار می رود.
ژلاتین در غلظت ۳/۰-۳ درصد بکار می رود. ژلاتین ماهی خصوصیات مناسب تری نسبت به ژلاتین پستانداران به عنوان ماده مسدود کننده دارد.
دترجنت (توین-۲۰) غلظت بین ۱/۰-۰۵/۰ درصد آن کافی است. راحت و کم هزینه است. از واکنش های غیر اختصاصی بین پروتئین ها نیز جلوگیری می کند.

تفاوت باند ها در western blot (وسترن بلات) و SDS-PAGE:

 

وسترن بلات در آنابیز

ما در آنابیز  با همکاری آزمایشگاه های معتبر و متخصصین مجرب سعی داریم تا شما پژوهشگران و محققان گرامی را در انجام هر چه بهتر آزمون western blot (وسترن بلات) همراهی نماییم

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *